該模型通過(guò)埋植雌激素，進(jìn)而建立了皮膚型狼瘡動(dòng)物模型，主要是檢測(cè)其dsDNA，腎臟變化，結(jié)合皮膚癥狀變化，來(lái)確定狼瘡皮膚病模型的建立。目前國(guó)際上尚欠缺類似模型，創(chuàng)新點(diǎn)在于該模型可快速建立模型，屬于誘導(dǎo)性狼瘡皮膚病模型，為研究狼瘡皮膚病發(fā)病機(jī)制提供了工具。目前國(guó)際無(wú)報(bào)道。

無(wú)安全性問(wèn)題。

（一）KM突變小鼠的遺傳特征

KM自發(fā)突變小鼠雄鼠F0與KM野生雌鼠交配得到表型正常的F1代；F1代雌雄互交得到F2代，有突變小鼠出現(xiàn)。目前F2代小鼠總數(shù)為227只，突變總數(shù)為65只（雌性37只，雄性28只），突變小鼠出現(xiàn)率為28.6%，突變雌雄的比例約為1:1；F2代突變雄鼠再與F1代雌性小鼠交配得到F3代，F(xiàn)3代有突變小鼠出現(xiàn)，F(xiàn)3代小鼠總數(shù)為204只，突變小鼠96只（雌性45只，雄性51只），突變小鼠出現(xiàn)率為47.1%，雌雄比例約為1:1；F3代突變雄鼠與表型正常雌性小鼠同窩交配得到F4代，F(xiàn)4代小鼠共174只，突變小鼠91只（雌性47只，雄性44只），突變小鼠出現(xiàn)率為51.7%，突變雌雄比例約為1:1。通過(guò)回交及測(cè)交實(shí)驗(yàn)表明KM突變小鼠出現(xiàn)率不受性別限制，突變基因不在性染色體上，進(jìn)而得到KM突變小鼠皮膚及毛發(fā)性狀的遺傳規(guī)律可能是單基因控制的常染色體隱性遺傳，與性別無(wú)關(guān)，符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律（分離規(guī)律）。自F3代開(kāi)始同窩兄妹互交至20代建立近交系KM突變小鼠品系。以F5-F8代為例，F(xiàn)5-F8代突變小鼠的出現(xiàn)率分別為50%、46.9%、51.3%和46.2%，且均無(wú)性別差異。（遺傳培育結(jié)果見(jiàn)表1，表2，匯總表3）

表1回交結(jié)果

表2 F1, F3-F8代同窩突變雄鼠與表型正常雌鼠測(cè)交結(jié)果

表3 KM突變小鼠的近交系培育結(jié)果

（二）模型的皮膚特征：

從外部表型來(lái)看，與野生型KM小鼠相比，該突變小鼠在出生1-5天觀察不到明顯異常，至6-7天被毛長(zhǎng)出后可與野生鼠區(qū)分開(kāi)，野生型小鼠全身由發(fā)育良好的被毛覆蓋，除爪、耳和尾之外全身呈白色外觀；而突變小鼠被毛稀少不能覆蓋全部皮膚，故保持粉紅色外觀直至離乳。成年后突變小鼠被毛稀疏，有部分小鼠頸背部、眼眶周圍出現(xiàn)脫毛，隨年齡增長(zhǎng)逐漸消瘦，皮膚松弛，頸背部皮褶增多，偶有皮屑出現(xiàn)，部分小鼠的頸前部和肩胛部皮膚出現(xiàn)潰瘍，伴有局部淋巴結(jié)增大。(圖1)

圖1 a.新生 KM野生小鼠（1天）b.新生KM突變小鼠（1天），兩者無(wú)明顯差別；c.新出生KM野生小鼠（6天），乳白色皮膚d.新出生KM突變小鼠（6天），體型小，粉紅色皮膚，可與同齡野生小鼠辨別e.（3月）突變小鼠被毛稀疏，皮膚干燥、皮膚皺褶，脫屑，消瘦f.（3月齡）KM正常小鼠。

（三）、KM突變小鼠與KM野生小鼠體重測(cè)量比較

KM突變小鼠的體重在相同年齡下均低于KM野生小鼠(P<0.01，或P<0.05)，雄性間差別更顯著。從小鼠生長(zhǎng)曲線（圖2）可見(jiàn)KM突變小鼠的體重隨年齡的增長(zhǎng)體重增長(zhǎng)較慢，雌雄鼠均低于同齡野生KM小鼠。圖中我們可看到KM突變雌雄小鼠在3W-12W內(nèi)體重幾乎相同，沒(méi)有性別差異，12W后，雄性小鼠的體重高于雌性小鼠體重，雄性突變小鼠體重開(kāi)始增加，而雌性小鼠體重?zé)o明顯變化直至6月齡以后才有所增長(zhǎng)，到7月齡之后雄性小鼠體重開(kāi)始下降，雌性小鼠體重也趨于穩(wěn)定。KM野生小鼠體重增長(zhǎng)迅速，且一直在隨年齡增加而增長(zhǎng)。

圖2 KM突變和KM野生小鼠體重比較

（四）KM突變小鼠日攝食、飲水測(cè)量

3、6月齡突變雌鼠、雄鼠日食量與野生鼠相比無(wú)明顯差異，3月突變雌鼠日飲水量高于同齡KM雌鼠（P＜0.05），6月齡突變雄鼠日飲食量，日飲水量均較野生鼠高，其中日飲水量升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表4，表5）

表4 3月齡突變和野生小鼠雌雄日攝食、飲水量的比較（x±S ）

同野生小鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；

表5 6月齡突變和野生小鼠雌雄日攝食、飲水量的比較（x±S ）

同野生小鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01。

（五）、KM突變小鼠血常規(guī)、生化測(cè)量

KM突變小鼠血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果為：WBC計(jì)數(shù)3月齡突變雌雄鼠均高于同齡野生（P<0.05），6月齡突變鼠高于野生鼠，其中6月突變雄鼠高于同齡野生鼠有意義（P<0.01），3月齡突變鼠低于6月齡突變鼠，其中雄性有意義（P<0.05）；RBC計(jì)數(shù)3月齡突變雌鼠高于6月突變雌鼠，且3月突變雄鼠高于同齡KM鼠（P<0.01）；HGB含量3、6月齡突變雌雄鼠均低于同齡野生鼠（P<0.01），3月突變鼠高于6月突變鼠含量；MCHC為3、6月齡突變雌雄軍低于同齡野生小鼠（P<0.05）；LYM計(jì)數(shù)3、6月齡突變雌雄鼠均高于同齡野生小鼠（P<0.01）,且3月突變雄鼠低于6月突變雄鼠（P<0.01）；LYM%3月齡突變雌雄鼠高于野生鼠（P<0.05），6月齡突變鼠高于野生鼠無(wú)明顯意義，但3月齡突變雄鼠低于6月齡突變雄鼠（P<0.01）；MON計(jì)數(shù)3、6月齡突變雌雄鼠均高于同齡野生鼠（P<0.01）,3月齡突變雄鼠低于6月齡突變雄鼠（P<0.01）；MON%發(fā)生同樣的變化；NEU3月突變雌鼠低于3月突變雄鼠（P<0.01）,3月突變雄鼠高于同齡KM鼠（P<0.01）；NEU%3、6月齡突變雌雄鼠均低于同齡野生小鼠（P<0.01）,3月齡突變雌雄高于6月齡突變雌雄鼠（P<0.01）；BSA3月突變雌鼠高于3月突變雄鼠，3月突變雄鼠低于6月突變雄鼠（P<0.05）；BAS%變化相同；ALY%3月突變雌鼠高于同齡野生鼠（P<0.01）,3月突變雄鼠低于6月突變雄鼠（P<0.01）。（見(jiàn)表6）

KM突變小鼠血生化檢測(cè)結(jié)果為：GLU3月齡突變雌雄鼠低于3月野生小鼠（P<0.01）,6月齡突變雄鼠低于6月野生雄鼠（P<0.05），且3月突變雌鼠低于3月突變雄鼠（P<0.01）；CHO3月齡突變此雄鼠低于3月野生鼠（P<0.01），3月突變雌雄低于6月突變雌雄鼠（P<0.01）；TG含量3月突變雄鼠低于3月野生鼠，6月突變雌雄鼠低于6月野生雌雄鼠（P<0.05），3月突變雌雄鼠高于6月突變雌雄鼠（P<0.01）,3月突變雌鼠低于3月突變雄鼠（P<0.05）；HDL-C3月突變雌雄鼠低于3月野生鼠，且低于6月突變雌雄鼠（P<0.01）；LDL-C3月突變雌雄鼠高于3月野生鼠，且高于6月突變雌雄鼠（P<0.01）；IgG含量3月突變雌鼠低于6月突變雌鼠，6月突變雄鼠高于6月野生雄鼠（P<0.05）。（見(jiàn)表7）

表6 突變小鼠與KM小鼠主要的血常規(guī)指標(biāo)比較（x±S）

同齡雌雄突變鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；不同齡突變鼠之間相比※P＜0.05 ，※※P＜0.01；

同齡突變鼠與KM鼠相比# P＜0.05，## P＜0.01

表7 突變小鼠及KM小鼠部分血生化指標(biāo)比較（x±S ）

同齡雌雄突變鼠相比*P＜0.05 ，**P＜0.01；不同齡突變鼠之間相比※P＜0.05 ，※※P＜0.01； 同齡突變鼠與KM鼠相比#P＜0.05，## P＜0.01.

（六）模型病理特點(diǎn)：

組織切片HE染色結(jié)果顯示KM突變小鼠表皮增厚（表8）（圖3），上皮細(xì)胞角化過(guò)度伴角化不全，顆粒層增厚，基底細(xì)胞層水腫；真皮淺層血管擴(kuò)張充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，毛囊數(shù)目減少（表8），部分毛囊細(xì)胞和皮脂腺細(xì)胞變性壞死，毛囊內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；皮下組織內(nèi)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，脂肪組織內(nèi)可見(jiàn)多核細(xì)胞。3月齡突變小鼠皮膚組織炎癥病變較重，皮下組織可見(jiàn)小膿腫，真皮和皮下組織彌漫性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)大量多核細(xì)胞；6月齡小鼠皮膚炎癥病變較3月齡有所減輕，有少量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原致密，皮下脂肪散在多核細(xì)胞。（圖4）

甲苯胺藍(lán)特染示肥大細(xì)胞：真皮層胞質(zhì)中含紫紅色顆粒、胞核藍(lán)色的細(xì)胞為肥大細(xì)胞。3月齡、6月齡均較正常鼠多見(jiàn)，3月齡突變鼠陽(yáng)性率高于6月齡（圖5）

圖3小鼠皮膚表皮厚度比較（HE）X100 A野生小鼠 B 突變小鼠

表8 實(shí)驗(yàn)小鼠皮膚表皮厚度和毛囊數(shù)目測(cè)量比較(計(jì)數(shù)/mm2) （x±S ）

與野生小鼠比較，﹡P<0.01；與6月齡野生小鼠比較，?P<0.01

圖4突變小鼠皮膚病理改變（HE）X100： A毛囊上皮細(xì)胞角化不全伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)； B真皮血管擴(kuò)張伴炎細(xì)胞浸潤(rùn)；C真皮水腫少量炎細(xì)胞浸；D真皮顆粒層增厚；E棕色脂肪周圍的白色脂肪內(nèi)多核細(xì)胞和多發(fā)性小膿腫；F皮下結(jié)締組織的炎細(xì)胞浸潤(rùn)；G,H為對(duì)照

圖5甲苯胺藍(lán)染色示肥大細(xì)胞x200：A.3月齡突變小鼠B.3月齡野生小鼠C.6月齡突變小鼠D.6月齡野生小鼠

（七）皮膚組織炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子改變

免疫組織化學(xué)染色對(duì)炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子進(jìn)行比較，圖像分析軟件計(jì)數(shù)鏡下單位視野（1mm2）內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)[2]，結(jié)果進(jìn)行半定量分析，結(jié)果顯示（表9）：KM突變小鼠3月齡皮膚炎癥細(xì)胞CD3、CD4T細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比3月齡KM野生小鼠多（P<0.05），主要在表皮和真皮組織；巨噬細(xì)胞表面抗原CD68、F4/80比3月齡KM野生小鼠皮膚陽(yáng)性數(shù)多(P<0.05)，其主要在真皮及皮下組織；B細(xì)胞表面標(biāo)記分子CD45R/B220兩者存在一定差異，但差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；炎癥因子IL-6、IL-22、TNF-α、INF-γKM突變小鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)也高于KM野生小鼠（P<0.05），這些炎癥因子也主要存在于真皮及皮下組織內(nèi)。6月齡KM突變小鼠炎癥細(xì)胞CD3、CD4T細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)比6月齡KM野生小鼠多，主要在表皮及真皮（P<0.01）；巨噬細(xì)胞表面抗原CD68陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比6月齡KM野生小鼠的多(P<0.01)，皮膚炎癥因子IL-6、TNF-α等也表現(xiàn)為6月齡KM突變小鼠比同月齡KM野生小鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多（P<0.01）（圖6）。KM突變小鼠3月齡和6月齡相比較：炎癥細(xì)胞CD3、CD4T細(xì)胞3月齡陽(yáng)性數(shù)明顯比6月齡的多（P<0.01）；CD68陽(yáng)性率也表現(xiàn)為3月齡高于6月齡，但目前未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；炎癥因子IL-6、TNF-α3月齡的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯比6月齡小鼠多，但I(xiàn)L-6未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表 9 小鼠皮膚炎癥細(xì)胞及細(xì)胞因子的檢測(cè)半定量比較（x±S ）

（八）皮膚組織細(xì)胞凋亡和增殖改變

（1）細(xì)胞凋亡改變

KM突變和KM野生小鼠9天、22天、3月齡和6月齡齡比較，各取5只，每只取5個(gè)部位，每個(gè)部位隨機(jī)選擇1mm2視野，記錄平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示四個(gè)年齡段的KM突變小鼠皮膚真皮層及毛囊周圍均有不同程度細(xì)胞凋亡，其中22天時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)最多，真皮層及毛囊大量細(xì)胞凋亡，突變小鼠多于同齡野生小鼠，其中3月、6月突變小鼠皮膚凋亡細(xì)胞增多具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；突變9天與突變22天、6月小鼠間凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差別分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），突變9天與突變3月，KM野生小鼠9天差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 突變小鼠22天時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)多于突變小鼠9天和3月齡，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01和P<0.05），與突變小鼠6月凋亡細(xì)胞數(shù)相比無(wú)顯著性差異；突變小鼠3月、6月之間凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（圖7,8）

圖7 小鼠皮膚凋亡染色x 200 A .突變9天 B.突變22天C.突變3月D.突變6月E.野生9天F.野生22天G.野生3月H.野生6月

圖8 小鼠皮膚凋亡染色統(tǒng)計(jì)圖

（2）細(xì)胞增殖改變

KM突變和KM野生小鼠9天、22天、3月和6月齡比較，各取5只，每只

取5個(gè)部位，每個(gè)部位隨機(jī)選擇1mm2視野，記錄平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。9天時(shí)，KM野生小鼠與KM突變小鼠表皮基底細(xì)胞差異無(wú)意義，但毛囊及皮脂腺陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)KM野生小鼠多于突變小鼠差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；22天時(shí)，KM野生小鼠與KM突變小鼠相比：KM野生小鼠表皮基底細(xì)胞陽(yáng)性數(shù)多、毛囊及皮脂腺陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)少，差別分別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.01）；3月齡 表皮及毛囊染色KM野生小鼠陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于KM突變小鼠（P<0.01）；突變小鼠表皮基底部細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)很少，毛囊及皮脂腺細(xì)胞不完全染色，而KM野生小鼠表皮基底部陽(yáng)性細(xì)胞排列均勻，連續(xù)，毛囊及皮脂腺細(xì)胞完全 ；6月齡KM突變小鼠表皮毛囊陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)多于KM野生小鼠，表皮P<0.01,毛囊P>0.05；KM突變小鼠表皮基底部細(xì)胞增厚，陽(yáng)性細(xì)胞增多，KM野生小鼠無(wú)太多變化，但野生小鼠毛囊陽(yáng)性細(xì)胞有所減少。（圖9,10）

圖9小鼠皮膚增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）染色 X200

A.野生9天B.野生22天C.野生3月D.野生6月E.突變9天F.突變22天G.突變3月H.突變6月

圖10 KM野生和突變小鼠皮膚增殖細(xì)胞統(tǒng)計(jì)

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明（KM）突變小鼠是我所KM封閉群小鼠繁殖過(guò)程中出現(xiàn)的自發(fā)突變小鼠，表型異常，全身被毛稀少，表皮增厚有皺褶。為進(jìn)一步育種研究，于SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)進(jìn)行近交化培育保種，其突變表型可穩(wěn)定遺傳。

2．模型培育方法

KM突變小鼠種鼠F0與KM小鼠雜交繁殖得到F1代雜合小鼠；再用F1代雜合小鼠自交得到F2代；然后用F1雜合雌鼠與F2代突變雄鼠交配得到F3代；同樣用同窩F3代突變雄鼠與雜合雌鼠交配得到F4代小鼠等，自F3代開(kāi)始同窩互交，連續(xù)繁殖至20代，培育KM突變小鼠的近交系，使群體基因達(dá)到高度純合和穩(wěn)定遺傳。

慢性炎癥性皮膚病常見(jiàn)的有銀屑病、濕疹、神經(jīng)性皮炎、斑禿、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)等。發(fā)病原因很多，如：感染、環(huán)境、內(nèi)分泌、代謝、免疫功能異常及遺傳等。發(fā)病范圍廣，發(fā)病率高，僅銀屑病的發(fā)病率就占世界人口的0.1%～3%，且反復(fù)發(fā)作，難以治愈，給患者帶來(lái)極大的痛苦，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，是醫(yī)學(xué)上仍未解決的難題之一，越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

目前對(duì)慢性炎癥性皮膚病的研究多集中在基因工程小鼠模型，主要通過(guò)皮膚上皮細(xì)胞角蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因和基因敲除小鼠模型，這種模型通常僅基于單基因操作，而此類疾病被認(rèn)為是多基因位點(diǎn)共同作用的結(jié)果，因此用這種小鼠模型來(lái)研究人類復(fù)雜炎癥性皮膚病是有缺陷的。也有一些自發(fā)突變模型小鼠，如：斑禿模型小鼠C3H /HeJ，狼瘡模型小鼠MRL/lpr、NZB/W.F1等，銀屑病樣表型的自發(fā)突變小鼠鱗狀皮膚小鼠（Ttc7fsn / Ttc 7fsn)、慢性增生性皮炎突變小鼠（Sharpincpdm/ Sharpincpdm)、純合皮質(zhì)突變小鼠（Scd1ab /Scd1ab)等，其表型及病理改變各不相同，均只能反映人類炎癥性皮膚病復(fù)雜的病理生理改變的一部分，且在應(yīng)用過(guò)程中有一定的局限性。如斑禿模型小鼠外顯率低，發(fā)病不穩(wěn)定；狼瘡模型小鼠來(lái)源困難，價(jià)格昂貴；銀屑病模型小鼠在皮損浸潤(rùn)的炎細(xì)胞中缺乏T細(xì)胞，并且抗銀屑病的藥物治療無(wú)效，因此它們也不是理想的動(dòng)物模型。

發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，研究表明此類疾病多為免疫細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫相關(guān)性疾病，包括細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜的功能及生長(zhǎng)因子、趨化因子、炎癥細(xì)胞之間的作用等。