新冠病毒滅活試驗(yàn)：結(jié)果評價
同時符合下列a)和b)的消毒因子判為消毒效果合格：
a) 去除殘留消毒劑效果的中和劑鑒定試驗(yàn)合格；
b) 懸液滅活試驗(yàn)，每次試驗(yàn)對新型冠狀病毒應(yīng)有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應(yīng)≥5.0或載體滅活試驗(yàn)，每次試驗(yàn)對新型冠狀病毒應(yīng)有效滅活，陽性對照組病毒滴度對數(shù)值應(yīng)≥4.0。

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新冠病毒滅活試驗(yàn)：試驗(yàn)步驟
新冠病毒滅活試驗(yàn)原理，是用細(xì)胞感染法測定消毒因子作用前后（或?qū)φ战M與實(shí)驗(yàn)組）樣本中病毒的量。以細(xì)胞病變作為判斷指標(biāo)，確定各組病毒的感染滴度，觀察消毒因子對新型冠狀病毒的滅活效果。
1、懸液法病毒滅活試驗(yàn)
a) 取待測消毒劑，用滅菌硬水稀釋至所需濃度的 1.25 倍，于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b) 病毒懸液的制備：取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與有機(jī)干擾物按照 1:1 比例混合作為消毒劑滅活試驗(yàn)用病毒懸液。
c) 消毒試驗(yàn)：取上述病毒懸液1份加入4份待檢消毒劑，立即混勻并記時。作用至規(guī)定時間，立即取出 0.1 mL，加入經(jīng)鑒定合格的 0.9 mL 中和劑中混勻；或用經(jīng)鑒定合格的除藥方法處理。
d) 對照組試驗(yàn)：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達(dá)到試驗(yàn)要求；陰性對照組用細(xì)胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細(xì)胞生長是否良好。
e) 以上各組按照終點(diǎn)稀釋法分別進(jìn)行病毒滴度測定。試驗(yàn)重復(fù) 3 次。
f) 終點(diǎn)稀釋法：用細(xì)胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞維持液。繼續(xù)放入二氧化碳培養(yǎng)箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，記錄細(xì)胞病變情況。
2、載體法病毒滅活試驗(yàn)
a) 取待測消毒劑，置于 20 ℃±1 ℃水浴中備用。
b) 病毒載體的制備：取滅菌載體片，滴染新型冠狀病毒晾干備用。
c) 消毒試驗(yàn)：取病毒載體置于消毒因子，作用至規(guī)定的時間后取出放入經(jīng)鑒定合格的中和劑或洗脫液 1.0 mL 中，作用 10 min,混勻洗脫。消毒器械載體布點(diǎn)應(yīng)置于最難殺滅部位，具體方法參照《消毒技術(shù)規(guī)范》。
d) 對照組試驗(yàn)：陽性對照組為病毒對照組，觀察病毒生長是否良好，病毒滴度是否達(dá)到試驗(yàn)要求；陰性對照組用細(xì)胞維持液作為陰性對照，觀察有無污染，細(xì)胞生長是否良好。
e) 以上各組按照終點(diǎn)稀釋法分別進(jìn)行病毒滴度測定。試驗(yàn)重復(fù) 3 次。
f) 終點(diǎn)稀釋法：用細(xì)胞維持液對待滴定樣本做 10 倍系列稀釋，吸取樣液 100 μL，接種于單層細(xì)胞培養(yǎng)板上，每個滴度接種 4 孔。在 36 ℃±1 ℃放置 1 h～2 h 后，取出培養(yǎng)板，更換細(xì)胞維持液。繼續(xù)二氧化碳培養(yǎng)箱中（36 ℃±1 ℃,5%±1% 二氧化碳）培養(yǎng) 3-4 天，顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，記錄細(xì)胞病變情況。

新冠病毒滅活試驗(yàn)：中和劑鑒定試驗(yàn)
鑒定試驗(yàn)旨在確定所選中和劑是否適用于擬進(jìn)行的細(xì)胞感染法病毒滅活試驗(yàn)。中和劑鑒定試驗(yàn)包括預(yù)試驗(yàn)和正式試驗(yàn)，通過預(yù)試驗(yàn)確定消毒劑、中和產(chǎn)物和中和劑等對細(xì)胞生長有無影響；通過所設(shè)各組試驗(yàn)結(jié)果綜合分析，確定所用中和劑是否對測試消毒劑有良好的中和作用，對試驗(yàn)用病毒和細(xì)胞株是否有害或不良影響；中和試驗(yàn)用消毒劑濃度應(yīng)為正式消毒試驗(yàn)最高濃度，作用時間最短不得少于30 s。試驗(yàn)重復(fù)3次。

新冠病毒滅活試驗(yàn)：載體的制備
1、載體應(yīng)根據(jù)消毒對象選擇相應(yīng)的材料。常用的材料有布片、玻璃片、不銹鋼片等，金屬載體一般用 12 mm 直徑圓形金屬片（厚 0.5 mm），其他材質(zhì)載體一般為方形，大小 10 mm×10 mm，特定用途的消毒因子可使用其他相兼容材質(zhì)的載體。
2、所用載體于染病毒前，應(yīng)進(jìn)行脫脂處理。脫脂過程應(yīng)嚴(yán)格按照如下步驟進(jìn)行：
a) 將載體放入含洗滌劑的水中煮沸 30 min;
b) 用自來水漂洗；
c) 用蒸餾水煮沸 10 min；
d) 用蒸餾水漂洗至 pH 呈中性；
e) 晾干，備用。
3、載體經(jīng)壓力蒸汽滅菌后烘干備用，試驗(yàn)前使用滴染法染病毒懸液。
4、滴染載體的病毒滴度對數(shù)值應(yīng)≥4.0。

新冠病毒滅活試驗(yàn)：細(xì)胞準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)所用Vero- E6細(xì)胞或其它細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)室常規(guī)傳代培養(yǎng)，置二氧化碳培養(yǎng)箱（36 ℃±1 ℃，5%±1% 二氧化碳）中培養(yǎng)至單層細(xì)胞備用。

新冠病毒滅活試驗(yàn)：病毒懸液的制備
取出-80 ℃低溫保存的新型冠狀病毒，室溫解凍后，與設(shè)定濃度的有機(jī)干擾物混合作為消毒劑滅活試驗(yàn)用病毒懸液。

新冠病毒滅活試驗(yàn)：試驗(yàn)器材
1、試驗(yàn)病毒與細(xì)胞
試驗(yàn)病毒為分裝保存并確定病毒滴度的新型冠狀病毒培養(yǎng)物，細(xì)胞株為非洲綠猴腎傳代細(xì)胞（VeroE6）或其它適合用于新型冠狀病毒增殖培養(yǎng)的細(xì)胞系。
2、有機(jī)干擾物
牛血清白蛋白。
3、試劑
消毒因子、中和劑、細(xì)胞消化液、細(xì)胞維持液和細(xì)胞培養(yǎng)液等。
4、儀器
二氧化碳培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、冰箱、水浴箱、II 級或 II 級以上生物安全柜等。
5、耗材
無菌帶濾芯tip頭、吸管、離心管、凍存管、試管、多孔細(xì)胞培養(yǎng)板、單道移液器、多道移液器等。
6、載體
可選用布片、玻璃片、不銹鋼片等。

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