1.評價指標體系

1.1行為學評分：通過大鼠神經損傷嚴重缺損評分（Neurological Severity Scores, NSS）對其前肢屈曲情況、肌張力、神經損傷情況進行評價。分數越高，動物的行為障礙越嚴重，缺血引起的神經損傷越嚴重。

①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面計為0分，如手術的對側前肢出現腕屈、肘屈曲計為1分，肩內旋計為2分，既有腕射屈曲又有肩內旋者計為3分；②將動物雙前肢置于金屬網上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分，同樣根據手術對側肢張力下降程度不同計為1、2、3分；③動物有不停向一側轉圈者，根據轉圈情況計為0-3分。

1.2TTC染色

1.3HE病理染色

2. 國內外現有模型的異同

3. 技術難點

（1）手術難度：本實驗室采用永久性大腦中動脈阻塞模型，該手術癥狀嚴重，若操作不熟練則動物死亡率較高，具有很大的難度，對操作人員具有很高的要求。

4. 創新性

5. 應用價值

本研究在SD大鼠上建立永久性缺血性腦卒中模型并進行了評價，可以用于藥物的篩選和機制探究。

動物飼養于中國中醫科學院中藥研究所的屏障環境，12 h 照明/12 h 黑暗( 照明: 8: 00-20:00) ，飼養期間給予動物標準飼料和潔凈飲水。本動物實驗遵守國際實驗動物倫理學要求。

3.1動物基本情況

與假手術組相比，模型組動物精神萎靡，進食量減少，活動減少，存活率如圖1所示。

圖1 各組動物造模后24、48、72h存活率

3.2動物神經損傷評價

由圖2可見，與Sham組比較，模型組大鼠前肢屈曲、肌張力和轉圈情況逐漸加重。如圖3所示，模型組大鼠3天行為總分顯著升高(P<0.001)，提示腦缺血可誘發異常行為和運動，統計第3天總得分與第1天總得分的差異以評價疾病進程，如圖所示，模型組大鼠運動能力在第3天顯著下降(P<0.001)。

圖2各組大鼠前肢屈曲、肌張力、轉圈情況

圖3各組大鼠行為學總分統計及第3天得分與第1天得分差異

3.3TTC評價腦組織梗死率

圖4 動物腦組織梗死率

TTC可將正常腦組織染成紅色，而將梗死區染成白色。如圖4所示，與Sham組相比，模型組梗死面積明顯增大(P<0.001)。

3.4動物腦組織病理變化

由圖5可見，模型組動物皮層和海馬體CA1、CA3、DG區可見組織結構變化，細胞丟失嚴重。

圖5動物腦組織HE染色

4討論和小結

缺血性腦卒中仍是威脅人類健康的疾病，臨床上有藥物治療、去骨瓣減壓術、介入治療等方法對腦卒中進行治療，主要非介入治療方法是針對急性期的血液循環障礙和神經元毒性采取的溶栓、抗炎抗氧化和減輕腦血腫水腫等措施控制繼發性腦損傷，腦血流的快速恢復是缺血性腦卒中的首選治療方法，是降低其病死率、致殘率的重要手段之一。卒中診療受到越來越多的重視，尋找有效的治療策略對缺血性卒中的預后極為重要。目前，越來越多的學者致力于天然藥物抗腦缺血再灌注損傷的研究，特別是植物源性天然藥物具有多種有益作用。

本研究在SD大鼠上建立永久性缺血性腦卒中模型并進行了評價，可以用于藥物的篩選和機制探究。

1.1實驗動物

雄性SD大鼠12只（購自北京市維通利華實驗動物技術有限公司），8周齡，體重280-330g，許可證號：SCXK2017-0005。動物購入后于SPF級動物房中飼養。自由進食給水，保持實驗室安靜，實驗室溫度22-25oC，濕度50-60%，明暗周期12h/12h。

1.2實驗材料

手術器械購于上海醫療器械(集團)有限公司手術器械廠；線栓購于北京西濃科技有限公司；TTC購于上海希格瑪高技術有限公司。

2實驗方法 2.1分組及

造模方法

適應性飼養4天，根據體重將動物隨機分為假手術組（n=6）和模型組（n=6），各組于第5天分別完成假手術和造模處理，并在第5、6、7天進行行為學評價。 所有大鼠在術前禁食12h，自由飲水。動物稱重后，用異氟烷氣體麻醉（5%深度麻醉，2% 維持麻醉），備皮，仰臥固定于鼠板。頸部正中切開皮膚，鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，仔細分離避免損傷迷走神經。向內找到頸總動脈（CCA），分離至血管表明光滑在CCA上墊兩根線，遠心端系一個活扣，兩根線之間的距離盡量拉大；向遠心端找到頸外動脈（ECA），穿線，結扎；用動脈夾夾閉頸內動脈（ICA）。用眼科鑷挑起CCA，用顯微彈簧剪在兩段線中間剪一小口；用眼科鑷插入直徑0.23~0.26mm的線拴，插到ICA血管夾位置后，系緊CCA遠心端的活扣以固定線拴，打開ICA上的血管夾；繼續插入線拴，直到(18±0.5)mm標記處，微遇阻力時停止。縛緊活扣，剪去多余的線頭和線拴尾部；用生理鹽水溶解青霉素鈉粉末，用注射器吸取青霉素鈉液體，沖洗頸部傷口，將腺體推入肌肉筋膜內層，縫合肌肉；將注射器針頭伸入縫合的肌肉縫隙中，推注青霉素鈉液體，清理后縫合皮部。假手術組大鼠只分離暴露頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，結扎頸外動脈。造模結束后，保留線栓至實驗終點，造成大鼠永久性缺血性腦卒中模型。

2.2觀察和行為學檢測 2.2.1 一般觀察

記錄動物體重，觀察動物毛發、精神狀態和動作靈活性等一般外在形態，記錄各組存活率。

2.2.2大鼠神經損傷嚴重缺損評分（Neurological Severity Scores, NSS）

造模24h、48h、72h后進行評分，如下。

①提鼠尾觀察前肢屈曲情況，如雙前肢對稱伸向地面計為0分，如手術的對側前肢出現腕屈、肘屈曲計為1分，肩內旋計為2分，既有腕射屈曲又有肩內旋者計為3分；②將動物雙前肢置于金屬網上，觀察雙前肢的肌張力。雙前肢肌張力對等且有力者計為0分，同樣根據手術對側肢張力下降程度不同計為1、2、3分；③動物有不停向一側轉圈者，根據轉圈情況計為0-3分。分數越高，動物的行為障礙越嚴重。

2.3取材及TTC染色

1.取腦組織：剪去右心耳后用預冷的生理鹽水灌流，斷頭處死（約耳后處），用剪刀縱向剪開皮膚和肌肉，暴露頭骨，將頭骨向兩側輕輕掰開，用眼科鑷夾斷視神經，剝離完整的嗅球、大腦和小腦，放入培養皿，用預冷的生理鹽水沖洗；

2.切片：腦組織擺放入大鼠腦模具后，用單面刀片進行切片，每隔2mm切一片，視神經分叉處插入第一支刀片，向上切2片，向下切4片；

3.染色：將切片置于裝有2% TTC染液的避光的六孔板中，置于37°C水浴鍋中孵育，每5min翻面以保證充分接觸染液，孵育20min后放入4%多聚甲醛固定30min；

4.拍照：固定后取出置于黑色容器上，用濾紙吸去邊緣水分，正反面分別拍照；

5.梗死面積統計：借助Image J測定梗死面積；計算梗死率，梗死率=（雙面梗死總面積/雙面腦切片總面積）×100%。

2.4HE染色

（1）預處理過程

使用常規方法對切片進行脫蠟，再水合，在二甲苯中浸泡5min，重復兩次，用無水乙醇浸泡5min，再在95%乙醇中浸泡5min，在85%乙醇中浸泡5min，在70%乙醇中浸泡5min，最后用PBS浸洗3min共3次。

（2）染色步驟

首先，將切片浸入試劑盒中的試劑一（核染液）染缸中染色3-5min，用水洗約30-60s；

其次，將洗滌后的切片浸入試劑二（分色液I）中約20s后用水洗約30-60s；

再次，將洗滌后的切片浸入試劑三（分色液II）中約40s后用水洗約30-60s；

最后，將洗滌后的切片置于試劑 死漿染液中進行染色，2min后再用試劑五（增色液）洗去多余的染液，共洗2次，用濾紙吸干試劑，封片進行鏡檢。

2.5 數據分析

采用 Graphpad Prism 9. 0，組間比較使用單因素方差分析或獨立樣本 t 檢驗。

1. 目的

缺血性卒中( Cerebral Ischemic Stroke，CIS) 是由腦的供血動脈狹窄或閉塞、腦供血不足導致腦組織壞死的總稱。統計資料表明，我國腦卒中的死亡率是歐美國家的4～5倍、日本的3.5倍；每年新發病例數超過200萬，死亡人數超過百萬。通過線栓法構建能夠很好模擬老年或有動脈粥樣硬化等基礎疾病的人群突發的高死亡率、預后較差的缺血性腦卒中，可用于缺血性卒中血管損傷的藥效評價。

2. 意義

腦卒中是疾病負擔的主要原因[1]，缺血性腦卒中占腦血管病的80%左右[2]，主要因腦血管局部動脈粥樣硬化、血栓脫落及血管損傷等導致腦供血動脈栓塞，從而引起相應腦組織缺血、壞死，具有患病率高、復發率高、死亡率高等特點，嚴重影響生活質量[3]。2021年發表的《中國腦卒中15年變化趨勢和特點》[4]顯示，在過去的近多年中，我國腦卒中現患人數高居世界首位，患病率呈上升趨勢且趨于年輕化，經濟負擔持續加重。

3. 國內外研究進展

國內外文獻中已報道的造成體力疲勞動物模型的方法有：線栓法、光化學誘導法、開顱法、雙側頸總動脈結扎等方法構建的一系列用于缺血性腦卒中的動物模型，其中，線栓法是最為常用的方法，具體操作為將一根特制的線栓沿頸總動脈或頸外動脈向內插入直至堵塞大腦中動脈，針對不同的實驗目的可調整具體的缺血和再灌注時間等，如有短暫大腦中動脈閉塞、缺血再灌注損傷、永久性大腦中動脈阻塞等。 我們采用雄性SD大鼠，通過線栓法建立永久性缺血性腦卒中模型，造模后連續3天觀察并記錄動物狀態、體重、行為學，并在造模后第3天借助TTC染色評價動物腦組織梗死面積，通過HE染色觀察腦組織病理變化。

參考文獻：

[1] Johnston SC, Mendis S, Mathers CD. Global variation in stroke burden and mortality: estimates from monitoring, surveillance, and modelling. Lancet Neurol. 2009 Apr;8(4):345-54.

[2] Randolph SA. Ischemic Stroke. Workplace Health & Safety. 2016, 64(9): 444.

[3] 《中國腦卒中防治報告2019》概要[J].中國腦血管病雜志,2020,17(05):272-281.

[4] 王亞楠,吳思緲,劉鳴.中國腦卒中15年變化趨勢和特點[J].華西醫學,2021,36(06):803-807.