該模型采用了CRISPR/Cas9技術(shù)，創(chuàng)新性地結(jié)合了人類遺傳學(xué)與動物基因編輯技術(shù)，首次在小鼠上重構(gòu)了與人類疾病類似的遺傳模式，在Tbx6基因上同時引入無效突變和promotor區(qū)域的亞效等位基因，并將二者結(jié)合，形成復(fù)合雜合突變并獲得相應(yīng)的脊柱畸形表型。該模型是國際上首創(chuàng)的復(fù)合雜合突變脊柱畸形表型，對于解釋先天性脊柱側(cè)凸的分子機(jī)制和發(fā)病過程具有極高的研究討論價值。

該基因編輯小鼠將在屏障隔離環(huán)境（北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心）內(nèi)進(jìn)行繁育、飼養(yǎng)及相關(guān)實(shí)驗(yàn)，其監(jiān)督管理措施由動物中心負(fù)責(zé)。屏障隔離期間將保持清潔，保證其具有SPF級別清潔度，減少感染及發(fā)病幾率。嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)室管理，防止小鼠外泄，實(shí)驗(yàn)設(shè)計時將禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通。上述措施將保證該動物模型的生物安全性，避免其影響生態(tài)環(huán)境。

1. Tbx6亞效等位基因的建立。

Tbx6基因調(diào)控區(qū)域的8個堿基敲除獲得mh等位基因（A），所采用的gRNA在如圖B，luciferase顯示亞效等位基因的轉(zhuǎn)錄活性（C），in situ顯示Tbx6 mh純合小鼠尾端的Tbx6表達(dá)下降（D）。Yang etal., Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

2. TACS小鼠的表型評估。

胚胎期E14.5野生型和TACS小鼠的阿爾新蘭染色結(jié)果，提示椎體和肋骨的異常（AB）。發(fā)生率在不同基因型的小鼠中如C所示。

3. TACS小鼠microCT

成年小鼠的背面和腹側(cè)觀，可見半椎體及脊柱側(cè)彎的表型，以及部分肋骨融合（AB）。不同基因型的脊柱表型統(tǒng)計在C。

4. 動物模型的評價與驗(yàn)證

涉及Tbx6基因敲除小鼠的動物模型實(shí)驗(yàn)包括新生小鼠及鼠胚胎的基因型驗(yàn)證、骨骼染色、骨骼組織的石蠟及冰凍切片染色、microCT掃描等等。評價指標(biāo)包括脊柱及肋骨的畸形狀態(tài)、胚胎骨骼發(fā)育情況等等。

1.小鼠基因型鑒定

l 取新生小鼠（P0到P10）鼠耳耳標(biāo)組織，置于EP管中，加入75ul堿性裂解液并金屬浴95攝氏度加熱15min；

l 冰上冷卻1min，加入75ul中和液獲得DNA原液；

l 按照MasterMix配方制備PCR體系，進(jìn)行PCR；

l 跑膠，切膠回收目的條帶，提純sanger測序。

2.骨骼染色

l 二氧化碳法處死小鼠，剝離全部皮膚及內(nèi)臟，小心去除脂肪組織；

l 置于95%乙醇溶液室溫過夜；

l 乙醇更換為100%乙酮室溫過夜，去除多余的脂肪組織，在關(guān)節(jié)處用針頭戳若干小孔；

l 更換100%乙酮為阿爾欣蘭染液（0.03% in 80% ethanol and 20% glacial acid），根據(jù)樣本周齡室溫浸染1-3天；

l 更換染液為0.05%茜素紅染液（1%KOH），根據(jù)樣本周齡室溫浸染1-3天；

l KOH脫色透明化1-3天，待軟組織透明化后梯度更換為Glycerol KOH溶液。

3.骨骼組織石蠟切片

l 骨骼組織分離，4%PFA于4攝氏度固定過夜

l PBS洗三遍，進(jìn)行EtOH脫鈣15天

l 上自動脫水機(jī)進(jìn)行脫水與石蠟預(yù)浸潤

l 石蠟包埋，切片

4.骨骼組織冰凍切片

l 骨骼組織分離，4%PFA于4攝氏度固定過夜

l PBS洗三遍，進(jìn)行EtOH脫鈣15天

l 30%蔗糖溶液脫水，optium預(yù)浸潤

l 冰凍包埋，切片

此前研究表明，TBX6無效突變聯(lián)合亞效等位基因可解釋約10%漢族人群先天性脊柱側(cè)彎的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制?；诖?，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計了Tbx6基因敲除小鼠，試圖在動物模型上再現(xiàn)TACS的表型。 采用CRISPR/Cas9技術(shù)，在FVB/NJ小鼠上進(jìn)行基因編輯。首先，在exon2上加入1bp的堿基插入，造成重要T-box區(qū)域的移碼突變，該移碼突變將嚴(yán)重影響Tbx6基因的正常功能，模仿人類遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)的無效突變。研究證實(shí)Tbx6純合突變的小鼠胚胎期致死，這與先前的研究一致。隨后，參考人類的亞效等位基因，我們在Tbx6基因的promotor區(qū)域進(jìn)行基因編輯，獲得了Tbx6亞效等位基因（Tbx6 mh），并在luciferase實(shí)驗(yàn)中證實(shí)其基因功能約為野生型Tbx6基因的70%。Tbx6mh/mh 和Tbx6+/-交配即獲得TACS小鼠。

一、疾病概述

先天性脊柱側(cè)凸（Congenital Scoliosis，CS）指由胚胎期脊柱骨性椎體發(fā)育異常引起的脊柱畸形，臨床定義為由椎體結(jié)構(gòu)異常導(dǎo)致的脊柱側(cè)方彎曲超過10度。脊柱發(fā)育的畸形異常源于母孕期4~6周椎體發(fā)育時期，目前認(rèn)為是一種高頻罕見病，其發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒約為1/1000。CS可單獨(dú)存在或與一些先天異常導(dǎo)致的器官綜合癥伴發(fā)。CS具有進(jìn)展快、畸形重、并發(fā)癥多等特點(diǎn)，嚴(yán)重時可致患者癱瘓，是造成青少年殘疾的主要疾病之一，給患者和家庭造成了嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。目前臨床治療CS以支具緩解或手術(shù)治療為主，缺乏病因?qū)W治療手段。

先天性脊柱側(cè)凸可按照其畸形類型被分為分節(jié)不良型、椎體形成不良型及混合型，其中，單純分節(jié)不良或椎體形成不良者約占80%，混合型約占20%。分節(jié)不良主要由于上下節(jié)段間骨性融合引起，可具有雙側(cè)融合（骨塊）、單側(cè)融合（骨橋）等特征。椎體形成不良會產(chǎn)生異形椎體，如楔形椎、半椎體、蝴蝶椎等。

CS的致病機(jī)制目前尚未完全闡明，國內(nèi)外已發(fā)表的研究工作集中在脊柱發(fā)育生物學(xué)和人類遺傳學(xué)的探索。從發(fā)育生物學(xué)角度，脊椎動物脊柱的發(fā)育主要包括體節(jié)形成（somitogenesis）和成骨（osteogenesis）兩個關(guān)鍵過程。目前已解釋的CS致病突變集中在影響體節(jié)分節(jié)和成骨成軟骨過程的基因及相關(guān)信號通路，其致病分子機(jī)制和臨床干預(yù)手段尚待進(jìn)一步闡明。

北京協(xié)和醫(yī)院及復(fù)旦大學(xué)團(tuán)隊(duì)前期研究提示，罕見的TBX6基因突變聯(lián)合常見TBX6亞效等位基因可導(dǎo)致以胸腰段半椎體為特征性臨床表型的先天性脊柱畸形，稱TBX6相關(guān)先天性脊柱側(cè)凸（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）。該遺傳分子診斷分型約可以解釋約10%的漢族人群CS遺傳學(xué)病因。TBX6是調(diào)控胚胎期中軸骨形成的重要節(jié)律基因，前期研究已解釋部分參與脊柱分節(jié)的分子機(jī)制，且在CS發(fā)病人群中的單核苷酸多態(tài)性存在變化。TBX6參與CS發(fā)生發(fā)展過程的具體分子機(jī)制尚待進(jìn)一步解釋。

二、模型背景

1、小鼠信息

FVB/NJ小鼠品系源自遠(yuǎn)交系Swiss鼠。1935年，在美國國立衛(wèi)生研究所NIH飼養(yǎng)，1966年起開始選育，在接種白日咳疫苗后，其中一系HSFS/N對組胺(Histamine)敏感。70年代初，在HSFS/N系第八代發(fā)現(xiàn)部份小鼠攜帶Fv1 b基因?qū) strain Friend白血病毒敏感，后育成Fv1b同型合子近交系，稱FVB。NIH、Jackson等保存。

FVB通用于基因轉(zhuǎn)殖實(shí)驗(yàn)，有強(qiáng)的繁殖力，產(chǎn)生一窩仔數(shù)多，受精卵有大而顯著的前核，易于顯微注射DNA，注射后活力強(qiáng)如C57BL/6 × SJL F1雜交鼠，遠(yuǎn)勝于C57BL/6 (Taketo et al., 1991)。

2、實(shí)驗(yàn)動物背景信息

該動物模型在FVB/NJ品系的基礎(chǔ)上，參照人類CS隊(duì)列遺傳學(xué)信息，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建相應(yīng)的Tbx6無效突變等位基因和promotor區(qū)域突變的亞效等位基因。

3、研究背景

此前研究表明，TBX6無效突變聯(lián)合亞效等位基因可解釋約10%漢族人群先天性脊柱側(cè)彎的遺傳學(xué)發(fā)病機(jī)制?；诖?，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計了Tbx6基因敲除小鼠，試圖在動物模型上再現(xiàn)TACS的表型。