PD-L1作為機(jī)體內(nèi)重要的免疫通路分子，其在結(jié)核等疾病中的作用機(jī)制尚不明確。PD-L1廣泛表達(dá)于多個(gè)免疫細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞是結(jié)核等疾病感染免疫的重要分子，是結(jié)核特征性肉芽腫病變的關(guān)鍵細(xì)胞，巨噬細(xì)胞上PD-L1表達(dá)在結(jié)核中發(fā)揮什么作用，需要巨噬細(xì)胞上PD-L1特異性敲除小鼠來進(jìn)行研究。

目前無文獻(xiàn)或者資源庫(kù)可以檢索到巨噬細(xì)胞上PD-L1特異性敲除的動(dòng)物模型，本課題組制備的模型巨噬細(xì)胞上PD-L1特異性敲除的動(dòng)物模型可以用于結(jié)核或其他巨噬細(xì)胞免疫機(jī)制相關(guān)的研究，PD-L1作為機(jī)體內(nèi)重要的免疫通路分子，該模型的應(yīng)用必將廣泛。

本模型不涉及除遺傳物質(zhì)重組對(duì)環(huán)境生態(tài)影響以外的其它安全性問題，本模型小鼠的保存、使用和處理均按照研究所倫理和安全委員會(huì)的要求執(zhí)行，可以確保不產(chǎn)生安全性問題。

1、基因鑒定：

圖2 PCR鑒定敲除小鼠的基因

2、 表型分析（包括生理生化、解剖學(xué)、生物學(xué)特征等）

繁殖性能：產(chǎn)仔率：89～95％??平均窩產(chǎn)仔數(shù)：6.98～7.48只??胎間隔：28～36天??離乳存活率：87～93％

2.2 流式檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞PD-L1表達(dá)

如下圖所示，表明該小鼠模型的巨噬細(xì)胞上PD-L1是特異性敲除的。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞、T和B細(xì)胞上PD-L1的表達(dá)

注：藍(lán)色峰為Flox/+ with cre小鼠，紅色峰為Flox/Floxwith cre小鼠，綠色峰為Flox/Flox no cre小鼠

（一）巨噬細(xì)胞上特異性小鼠制備的原理

條件性基因敲除小鼠的設(shè)計(jì)利用了位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)Cre/LoxP原理，需要在待敲除的一段目標(biāo)DNA序列的兩端各放置一個(gè)loxP序列，得到flox(flanked by loxP)小鼠。將flox小鼠與帶有組織或細(xì)胞特異性表達(dá)cre的小鼠交配繁殖，以獲得在特定細(xì)胞或者組織里把目的基因敲除掉的小鼠，即條件性基因敲除小鼠。

如下圖：

圖1 特異性敲除的原理

（二）條件敲除小鼠的繁殖和鑒定

1. 收到F0和F1小鼠后，首先確認(rèn)每只小鼠的腳趾編號(hào)是否吻合。

2. F0和F1小鼠由于數(shù)量較少，以后需要的動(dòng)物多，與野生交配，盡量多繁殖，以備后續(xù)的研究。

3. 獲得小鼠后，提取基因組DNA，PCR擴(kuò)增，進(jìn)行基因型鑒定，并利用流式進(jìn)行表型鑒定。

4. 繁殖方法有多種，以下為一種舉例：

首先將PD-L1Flox/-小鼠和C57BL/6小鼠進(jìn)行雜交，得到PD-L1Flox/-小鼠，然后將PD-L1Flox/-小鼠進(jìn)行自交，得到PD-L1Flox/Flox小鼠，將雌性PD-L1Flox/Flox小鼠和帶有巨噬細(xì)胞特異性表達(dá) Cre 酶的Lyz2-iCre雄鼠進(jìn)行雜交，得到PD-L1Flox/- with Cre小鼠，最后將PD-L1Flox/Flox小鼠和PD-L1Flox/- with Cre小鼠雜交，得到1/4的PD-L1Flox/Flox with Cre小鼠，即為巨噬細(xì)胞特異性PD-L1敲除小鼠。

1、xx（細(xì)胞/基因/病原/其他造模因素）信息

利用 CRISPR/Cas9技術(shù)，特異性敲除小鼠巨噬細(xì)胞上的PD-L1基因

2、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

該動(dòng)物模型的研究目的及意義；該動(dòng)物模型的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展并附參考文獻(xiàn)。

PD-L1作為機(jī)體內(nèi)重要的免疫通路分子，其在結(jié)核等疾病中的作用機(jī)制尚不明確。PD-L1廣泛表達(dá)于多個(gè)免疫細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞是結(jié)核等疾病感染免疫的重要分子，是結(jié)核特征性肉芽腫病變的關(guān)鍵細(xì)胞，巨噬細(xì)胞上PD-L1表達(dá)在結(jié)核中發(fā)揮什么作用，需要巨噬細(xì)胞上PD-L1特異性敲除小鼠來進(jìn)行研究。