給予動物鼠籠傾斜、潮濕墊料、高溫、噪音、束縛、電擊、游泳、晝夜節(jié)律顛倒等不同刺激因子，且刺激因子安排為多變性和不可預(yù)測，可誘導(dǎo)性是模型制造成功的關(guān)鍵。該模型被廣泛用于抑郁癥神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制及抗抑郁藥物的研究，以及伴發(fā)的焦慮、學(xué)習(xí)記憶障礙及防護(hù)藥物研究。

本研究中，通過水迷宮實驗、避暗實驗結(jié)果可以看CUMS模型組水迷宮尋臺潛伏期顯著性延長，避暗錯誤次數(shù)顯著性增加、避暗潛伏期顯著性減少等，這些行為學(xué)結(jié)果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本實驗還對CUMS模型的機(jī)制進(jìn)行了基礎(chǔ)研究，認(rèn)為CUMS模型會導(dǎo)致動物皮層的5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)水平顯著性降低（P<0.05）。因此我們認(rèn)為采用慢性不可預(yù)測應(yīng)激，35天可以造成大鼠和小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

模型技術(shù)難點(diǎn)在于對于CUMS刺激因子的選擇，刺激因子的選擇可能影響實驗?zāi)Ｐ偷某晒εc否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、熱水游泳(42 °C，5 min)、動物叫聲(0.5 h)、束縛(使用自行研發(fā)的小鼠行為限制器，長20 cm，直徑7 cm)、晝夜顛倒、配對飼養(yǎng)、濕籠、傾籠等。每日選擇2~3 種刺激，并盡量使應(yīng)激程序符合不可預(yù)測的特點(diǎn)，以避免動物產(chǎn)生適應(yīng)性。相同的刺激因子應(yīng)該隔3-7日再進(jìn)行。

本研究通過不同的刺激因子對老鼠造成慢性不可預(yù)測應(yīng)激模型，通過水迷宮、避暗等經(jīng)典行為學(xué)指標(biāo)，以及5-HT、DA、Ach、NE等神經(jīng)遞質(zhì)基礎(chǔ)機(jī)制指標(biāo)，表明了慢性不可預(yù)測應(yīng)激誘導(dǎo)老鼠學(xué)習(xí)記憶損傷模型的成功，并且該模型對于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于進(jìn)一步的改善學(xué)習(xí)記憶藥物的藥效學(xué)評價。

本實驗采用健康成年SPF級老鼠。飼料墊料均為高壓滅菌產(chǎn)品，購自北京維通利華實驗動物有限公司，動物用水均經(jīng)過除菌處理。實驗動物以完整的包裝直接進(jìn)入實驗室，觀察適應(yīng)5天后無異常情況，方進(jìn)行實驗。實驗過程中動物操作均符合動物倫理學(xué)規(guī)范，對環(huán)境和生態(tài)影響等符合國家相關(guān)法律規(guī)定。

1、注射HD患者腦提取物的恒河猴腦部病理表型

亨廷頓蛋白免疫熒光染色：

為了觀察注射入紋狀體的HD患者腦提取物在動物腦內(nèi)的分布情況以及對神經(jīng)細(xì)胞的影響，在立體定位注射手術(shù)后8個月，注射部位免疫熒光染色的結(jié)果如圖1 A-F所示，注射部位神經(jīng)元（MAP2，綠色）、星形膠質(zhì)細(xì)胞（GFAP，綠色）、小膠質(zhì)細(xì)胞（Iba1，綠色）以及mHTT（EM48，紅色）免疫熒光染色結(jié)果顯示，（D-F）注射HD患者腦提取物的部位，mHTT陽性聚集物（紅色圓圈所示）集中在細(xì)胞外，以及神經(jīng)元內(nèi)。（G-I）Western blot結(jié)果顯示，HD患者腦提取物注射部位神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞以及小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的標(biāo)志物，與對照組沒有明顯差異。

立體定位注射手術(shù)后8個月，免疫熒光染色檢測注射部位mHTT的分布情況（A-F）。Western blot檢測注射部位神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物的變化（G-I）。

2、注射HD患者腦提取物的恒河猴行為學(xué)表現(xiàn)

Viewpoint視頻監(jiān)測系統(tǒng)檢測動物運(yùn)動量

在腦立體定位注射HD患者腦提取物手術(shù)后，通過Viewpoint視頻系統(tǒng)對動物進(jìn)行運(yùn)動量檢測，結(jié)果如圖2所示，與對照組動物相比，（A）注射HD患者腦提取物動物的總運(yùn)動距離無明顯差異，（B）動作劇烈程度的分布無顯著差異，靜止、中等強(qiáng)度和劇烈活動的比例無明顯差異。對照組和模型組動物的活動量無明顯差異。

取物試驗（Object retrieval task）

在腦立體定位注射HD患者腦提取物手術(shù)后，通過取物試驗檢測模型組和對照組動物的運(yùn)動和認(rèn)知功能水平。結(jié)果如圖3所示，與對照組相比，（A）注射HD患者腦提取物后，模型組動物在取物訓(xùn)練過程中出現(xiàn)的運(yùn)動錯誤數(shù)量無明顯差異，（B）模型組動物取物訓(xùn)練過程中出現(xiàn)的認(rèn)知錯誤無明顯差異，（C）各組動物一次嘗試即正確完成的成功率無明顯差異。結(jié)果反映，模型組與對照組在上肢運(yùn)動和認(rèn)知功能上無明顯差異。

將含有突變亨廷頓蛋白的病人腦組織勻漿通過腦立體定位注射的方法注射到恒河猴（5-6周歲，體重5-7公斤）雙側(cè)紋狀體內(nèi)，從而建立亨廷頓病的恒河猴模型。注射用的亨廷頓病人腦組織勻漿含有42個CAG序列的亨廷頓蛋白，每只動物注射200μl。

一、疾病名稱

亨廷頓病（Huntington’s disease，HD）

二、HD簡介

臨床癥狀主要表現(xiàn)為舞蹈樣不自主動作、精神障礙和進(jìn)行性癡呆，稱為“三聯(lián)征”。

病理表現(xiàn)主要為基底節(jié)區(qū)萎縮，其中以尾狀核最為明顯，殼核和蒼白球也有不同程度的萎縮。神經(jīng)元缺失主要見于基底節(jié)區(qū)和皮質(zhì)。

發(fā)病機(jī)制是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病。患者第四號染色體上的Huntington基因發(fā)生變異，產(chǎn)生了變異的mHTT，在細(xì)胞內(nèi)逐漸聚集，形成大的分子團(tuán)，在腦中積聚，影響神經(jīng)細(xì)胞的功能。

三、亨廷頓蛋白與HD

huntington基因處在第4號染色體的上部，亨廷頓病是由于huntington基因第1外顯子內(nèi)部不穩(wěn)定的CAG三核苷酸重復(fù)序列異常擴(kuò)展而發(fā)病，屬于三聯(lián)體重復(fù)序列疾病。等位基因CAG的重復(fù)數(shù)在正常人多在26次以下，HD患者則多超過40.5次，平均46.42次，可高達(dá)100次。

huntington蛋白在全身各個器官包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，其正常功能尚未完全明確，可能與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、細(xì)胞內(nèi)吞和分泌及抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。亨廷頓病患者h(yuǎn)untington基因的重復(fù)CAG序列可產(chǎn)生一段多聚谷氨酰胺鏈（polyglutamine，polyQ），連于HTT的末端，使HTT與其他蛋白結(jié)合形成不溶性復(fù)合物（核內(nèi)包涵體形成），并與其他蛋白相互作用，使神經(jīng)元內(nèi)蛋白錯誤折疊，影響蛋白的進(jìn)展和降解過程，產(chǎn)生毒性功能。