動(dòng)物癥狀觀察：

表現(xiàn)為體重減輕、弓背豎毛，在回輸后的一個(gè)月后死亡。

實(shí)驗(yàn)中涉及動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn)(ILAS-GC-2012-001)。

1、CCKBR基因敲除及高鹽飲食小鼠血壓情況

高鹽喂養(yǎng)8周后，通過(guò)左頸動(dòng)脈插管法檢測(cè)小鼠的血壓，我們發(fā)現(xiàn)，胃泌素受體敲出小鼠的血壓相比于野生型小鼠明顯升高。給予高鹽飲食之后，胃泌素受體敲除小鼠的血壓進(jìn)一步升高。而野生型小鼠的血壓沒(méi)有明顯升高。說(shuō)明小腸CCKBR確實(shí)能夠參與小鼠血壓的調(diào)節(jié)。

2、CCKBR基因敲除及高鹽飲食小鼠尿鈉情況

我們使用代謝籠對(duì)四組小鼠的尿液進(jìn)行收集并檢測(cè)，結(jié)果表明與野生型小鼠相比，胃泌素受體敲除小鼠的尿鈉水平降低。和給予高鹽飲食的野生型小鼠相比，給予高鹽飲食的胃泌素受體敲除小鼠的尿鈉水平也顯著降低。說(shuō)明CCKBR基因敲除及高鹽飲食能夠誘導(dǎo)小鼠鈉水代謝異常，進(jìn)而誘發(fā)高血壓。

3、CCKBR基因敲除及高鹽飲食小鼠小腸刷狀緣膜上NHE3調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)

為了進(jìn)一步確定胃泌素受體敲除后，小腸絨毛刷狀緣膜上NHE3調(diào)節(jié)蛋白的作用，我們提取了CCKBR+/+小鼠和CCKBR-/-小鼠對(duì)照組和高鹽組小腸的膜蛋白，我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組CCKBR-/-小鼠和對(duì)照組CCKBR+/+小鼠相比，NHE3、NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和IRBIT的表達(dá)升高，高鹽飲食之后，CCKBR-/-小鼠小腸膜蛋白中NHE3、NHERF1、NHERF2、NHERF3、ezrin和IRBIT的表達(dá)進(jìn)一步升高。這說(shuō)明胃泌素受體缺失之后，胃泌素對(duì)NHE3調(diào)節(jié)蛋白的抑制作用消失，進(jìn)一步誘發(fā)鈉水平衡失調(diào)以及高血壓的發(fā)生發(fā)展。

(1)品系來(lái)源：1.C57小鼠，C57-CCKBR-Vilin-Cre

對(duì)照：C57 -CCKBR-Vilin-FloxP

品系來(lái)源 ：1)遺傳背景及亞系:1921年Ltle用 AbbgLathrop的小鼠株雌鼠57號(hào)與雄鼠52號(hào)交配，而得C57BL6。亞系:C57BL6、C57B/6、C57BL/6N等。

(2)毛色基因標(biāo)記：aa、BB、CC（黑色）

(3) 主要遺傳學(xué)特征：a免疫學(xué)特征：一般飼養(yǎng)條件下免疫球蛋白的量隨年齡而增加，而到生后20個(gè)月時(shí)則1gG增長(zhǎng)緩慢，無(wú)菌飼養(yǎng)的絕對(duì)量較低。gM水平較高，出生12月以后，有的個(gè)體超過(guò)80ug/mL。無(wú)菌飼養(yǎng)的動(dòng)物lgM量比一般飼養(yǎng)的高。細(xì)胞免疫低下者少見，這可能與自發(fā)腫瘤少有關(guān)。b。形態(tài)學(xué)特征：在新生鼠中，雌鼠為16.8%，雄鼠3%為小眼或無(wú)眼癥。0.6%后肢可見多趾癥，另外水頭癥占2%4%，耳頭癥占0.4%，交合不全占3%。c生理學(xué)特性：有強(qiáng)嗜酒精性。對(duì)放射性照射為中等強(qiáng)度感應(yīng)度，LD50為630+4R，將雄鼠皮膚移植到同系的雌鼠身上，約20日被排斥掉，這是因?yàn)樵诮M織相容性抗原中的雄抗原在C57BL中非常顯著。d癌發(fā)生率：乳癌發(fā)生率低，為01%，白血病為7%-16%化學(xué)致癌成功率低，放射性照射較容易誘發(fā)肝癌。

(4)誘導(dǎo)方法：利用Cre/LoxP（特異性重組酶系統(tǒng)）原理構(gòu)建小腸CCKBR特異性敲除鼠（CKBR-Vilin-Cre），即在待翹除的目的基因CCKBR的DNA兩端各放置一個(gè)Loxp序列，得到flox小鼠（flankedby loxP），將flox小鼠與帶有小腸細(xì)胞特異性表達(dá)Cre的小鼠進(jìn)行交配繁殖，已獲得在小腸把CCKBR敲除掉的CCKBR-Vilin-Cre小鼠。

8周齡CCKBR-Vilin-Cre小鼠及其對(duì)照CCKBR-Vilin-FloxP，分別給予高鹽飲食（8%的NaCl）和正常鹽飲食（4%的NaCl），連續(xù)8周，每周測(cè)量血壓。

高血壓是由多基因、多環(huán)境因素及個(gè)人不良習(xí)慣相互作用而導(dǎo)致的一種慢性復(fù)雜疾病，也是危害人類健康的主要疾病之一。鹽是高血壓的重要環(huán)境因素，個(gè)體對(duì)鹽負(fù)荷或限鹽呈現(xiàn)不同的血壓反應(yīng)，因此存在鹽敏感性問(wèn)題。因此在高血壓臨床診治過(guò)程中，考慮鹽敏感性將有利于對(duì)高血壓分類、危險(xiǎn)分級(jí)以及對(duì)癥治療。

鹽敏感性通常涉及人口、種族、社會(huì)因素以及腎功能、激素水平和飲食習(xí)慣等 。不同種族和人群鹽敏感性個(gè)體的檢出率不同，而且血壓的鹽敏感性隨年齡增長(zhǎng)而變化，特別是高血壓患者。鹽敏感性由Weinberger給出定義：靜脈滴注2L生理鹽水，測(cè)量平均動(dòng)脈壓（MAP），次日早晨給予低鈉飲食后再測(cè)量MAP，兩次MAP相差≥10mmHg為鹽敏感性，否則為鹽耐受性。定義鹽敏感指數(shù)（SSI）為低鹽和高鹽飲食后MAP的差值與低鹽飲食MAP的商，若SSI≥5%為鹽敏感性。

高鹽攝入引起血壓升高主要有兩方面原因：一方面是腎小管對(duì)Na+ 重吸收增加，導(dǎo)致水鈉潴留，血漿容量增加，從而血壓升高；另一方面是內(nèi)源性哇巴因物質(zhì)分泌增多，特異性抑制鈉泵，胞內(nèi)鈉離子濃度增加，Na+/Ca2+交換體被激活，細(xì)胞內(nèi)Ca2+ 濃度升高，最終導(dǎo)致血管平滑肌或心肌收縮，引起高血壓 ，可見鈉水調(diào)節(jié)紊亂是鹽敏感性高血壓發(fā)病的主要誘因。有研究表明，胃腸道在維持機(jī)體鈉水平衡方面具有重要的作用。人體胃腸道每天大約吸收7～9升液體，這一吸收過(guò)程主要是由鈉依賴的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)同向轉(zhuǎn)運(yùn)體和鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)體共同介導(dǎo)。在基礎(chǔ)狀態(tài)和進(jìn)食后，小腸內(nèi)鈉吸收主要是通過(guò)鈉氫交換體（NHE）。在小腸細(xì)胞的頂膜上，將腸腔內(nèi)的鈉轉(zhuǎn)運(yùn)至小腸細(xì)胞的電中性鈉氫交換體主要有NHE2、NHE3和NHE8，在結(jié)腸中主要的電中性鈉吸收通道為ENaC。在這些鈉吸收通道中NHE3是非常重要的一個(gè)鈉離子吸收通道[28-30]。但小腸NHE3的特異性作用還不清楚。DR. Rieg構(gòu)建了小腸特異NHE3敲除小鼠VillinCre, 并發(fā)現(xiàn)該小鼠成年率為0，均為出生后幾天死亡 ，證實(shí)腸道中NHE3調(diào)節(jié)鈉水平衡至關(guān)重要。

基于腸道NHE3對(duì)于機(jī)體鈉水平衡的調(diào)節(jié)作用，相關(guān)領(lǐng)域已經(jīng)開展了NHE3抑制劑藥物用于高血壓治療的研究，但是NHE3抑制劑都存在明顯的副作用，大鼠及人體實(shí)驗(yàn)證實(shí)NHE3抑制劑藥物能夠引發(fā)中度或重度腹瀉。已有測(cè)序研究發(fā)現(xiàn)NHE3編碼基因SLC9A3與先天性鈉腹瀉（CSD）密切相關(guān)，SLC9A3 基因N端鈉離子轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域發(fā)生突變，能夠引發(fā)NHE3功能缺失，從而誘導(dǎo)CSD發(fā)生[34]。提示直接抑制NHE3的藥物雖然能夠顯著降低血壓及鈉離子重吸收，但無(wú)法解決對(duì)機(jī)體的副作用。因此，我們研究通過(guò)其它通路間接抑制NHE3功能來(lái)降低血壓。最新研究發(fā)現(xiàn)，胃泌素不僅能夠調(diào)節(jié)胃酸分泌，還對(duì)機(jī)體內(nèi)腎臟鈉氫交換體3（NHE3）等離子泵具有重要的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，我們實(shí)驗(yàn)室先前的研究結(jié)果也表明，胃泌素能夠通過(guò)抑制NHE3活性參與機(jī)體鈉水代謝和血壓調(diào)節(jié)，從而改善鹽敏感性高血壓大鼠的血壓狀況。由于小腸中存在大量的胃泌素受體，因此我們采用基因工程的方法，敲除小腸道CCKBR基因以抑制胃泌素對(duì)NHE3活性的調(diào)節(jié)作用，從而造成胃腸道鈉水平衡的失調(diào)，誘導(dǎo)小鼠鹽敏感性高血壓模型。