腸道病毒71型BALB/c小鼠模型
討論與結(jié)論
采用病毒滴度為104.5 TCID50/ml的EV71（NX10-147）經(jīng)腹腔注射感染9日齡BALB/c乳鼠，建立重癥小鼠模型，6 dpi重癥模型小鼠發(fā)生后肢癱瘓最終導(dǎo)致死亡；繪制生存率（圖1A），體重增長(zhǎng)曲線（圖1B），臨床評(píng)分（圖1C）。重癥小鼠模型在5 dpi時(shí)，2/7(28.57%)小鼠發(fā)生后肢癱瘓（圖2），在7 dpi時(shí)，4/7(57.14%)小鼠表現(xiàn)癱瘓，其體重也下降，11~12 dpi重癥小鼠出現(xiàn)死亡，生存率為71.43%(5/7)，其中存活的小鼠中60%(3/5)出現(xiàn)癱瘓后遺癥。
1.重癥小鼠模型各組織病毒載量檢測(cè)
為了進(jìn)一步探討重癥EV71小鼠模型體內(nèi)病毒載量情況，采用RT-PCR對(duì)3 dpi和5 dpi重癥小鼠腦、脊髓、骨骼肌、空腸和肺組織進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)（圖3），發(fā)現(xiàn)以上各組織在3 dpi和5 dpi 均檢測(cè)到EV71病毒，其中，檢測(cè)到重癥模型3 dpi骨骼肌中的高病毒載量（107.0 copies/mg），其中，3 dpi 在重癥模型腦組織中均檢測(cè)到低病毒載量(102.0 copies/mg)，5 dpi腦組織中病毒載量增加到104.0 copies/mg，說(shuō)明5 dpi EV71病毒造成中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染加重。3 dpi在重癥模型脊髓、空腸和肺組織中的病毒載量104.0 copies/mg，5 dpi 病毒載量無(wú)明顯變化，重癥小鼠模型中均檢測(cè)到骨骼肌和脊髓中較高的病毒載量，說(shuō)明這些組織是病毒復(fù)制并傳播到腦組織的重要部位。
2.重癥小鼠模型組織病理學(xué)變化
運(yùn)用組織病理學(xué)和免疫組織化學(xué)技術(shù)，對(duì)重癥小鼠模型的各組織器官進(jìn)行病理學(xué)觀察。空白對(duì)照組小鼠未見(jiàn)明顯病理變化，并且EV71抗原呈陰性反應(yīng)。
對(duì)重癥小鼠模型（NX10-147）進(jìn)行組織病理學(xué)觀察（圖4），發(fā)現(xiàn)3 dpi和5 dpi 小鼠后肢骨骼肌發(fā)生嚴(yán)重的壞死性肌炎，肌纖維斷裂，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要有淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞；3 dpi 小鼠脊髓和腦干發(fā)生細(xì)胞源性水腫，神經(jīng)元發(fā)生變性，偶見(jiàn)壞死，5 dpi小鼠脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性壞死，出現(xiàn)紅色神經(jīng)元，并可見(jiàn)衛(wèi)星現(xiàn)象和嗜神經(jīng)現(xiàn)象，腦干組織中的神經(jīng)元發(fā)生不同程度的變性壞死，并且可見(jiàn)腦干和脊髓神經(jīng)元中的尼氏小體消失；5 dpi肺臟發(fā)生大面積間質(zhì)性肺炎，間質(zhì)增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔毛細(xì)血管淤血，3 dpi和5 dpi肺臟發(fā)生局灶性肺氣腫；3 dpi和5 dpi空腸黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生大面積空泡變性。免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在上述嚴(yán)重病變的組織中可觀察到EV71特異性抗原分布（圖5），在3dpi和5 dpi時(shí)，脊髓、腦干、空腸和骨骼肌檢測(cè)到較強(qiáng)的陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)，提示在這些組織中病毒復(fù)制活躍，然而在5 dpi時(shí)，肺臟檢測(cè)到中等強(qiáng)度陽(yáng)性EV71抗原信號(hào)。
3.重癥小鼠模型血清細(xì)胞因子檢測(cè)
對(duì)重癥小鼠模型進(jìn)行血清細(xì)胞因子檢測(cè)從血清細(xì)胞因子方面揭示重癥發(fā)生機(jī)制。本研究采用CBA方法檢測(cè)了重癥小鼠的3、6、12 hpi 以及1、2、3、5、7、9 dpi的血清細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、TNF-α、IFN-γ，以及MCP-1、CCL5/RANTES的動(dòng)態(tài)變化（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些血清因子中，IL-5、IL-13、IL-6、MCP-1、CCL5、TNF-α在重癥小鼠中發(fā)生某時(shí)間點(diǎn)的爆發(fā)性濃度增高，與空白對(duì)照組小鼠血清因子相比，發(fā)現(xiàn)重癥小鼠血清爆發(fā)性增高的細(xì)胞因子分別是3 hpi重癥IL-5上調(diào)4倍；48 hpi重癥IL-13上調(diào)1.2倍；3 dpi重癥IL-6、MCP-1都上調(diào)100倍以上；3 dpi和7 dpi重癥CCL5/RANTES分別上調(diào)9倍和10倍；重癥小鼠模型中的IFN-γ在5 dpi時(shí)達(dá)到峰值，重癥為10倍；7 dpi重癥TNF-α和MCP-1分別上調(diào)4倍和87倍。以上數(shù)據(jù)說(shuō)明，IL-5和IL-13可能是EV71小鼠實(shí)驗(yàn)感染早期炎癥反應(yīng)的主要因素，并且細(xì)胞因子IL-6、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、CCL5/RANTES在重癥EV71實(shí)驗(yàn)感染的免疫病理?yè)p傷中發(fā)揮重要作用。
4. EV71重癥小鼠模型的氣道阻力和血?dú)夥治?/strong>
對(duì)小鼠的氣道阻力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)小鼠的吸氣時(shí)間延長(zhǎng)，呼吸頻率降低，分鐘通氣量顯著降低（圖7），符合限制性通氣不足的特征，可能是小鼠死亡的主要原因之一。
采用血?dú)夥治龇椒▽?duì)EV71重癥小鼠模型組和對(duì)照組小鼠的呼吸效果進(jìn)行分析，與對(duì)照組相比，4 dpi感染組小鼠的氧分壓（PO2）和氧飽和度（sO2）均明顯下降，PO2 由62.2 mmHg下降到 46.75 mmHg，差異極顯著（p < 0.01）（圖8A）；sO2由90.6 %下降到76.5 %，差異極顯著（p< 0.01）（圖8B），PO2和sO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠處于缺氧狀態(tài)。并且發(fā)現(xiàn)二氧化碳分壓（PCO2）和二氧化碳總量（TCO2）有所上升，PCO2由27.22 mmHg增加到46.25 mmHg，差異顯著（p< 0.05）（圖8D）；TCO2由24.00 mmol/L 增加到25.75 mmol/L（圖8E），PCO2的變化提示EV71重癥模型組小鼠肺通氣效果可能存在障礙。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了血液酸堿度pH值和細(xì)胞外液堿剩余（BEecf）均明顯下降，pH值由7.42下降到7.33，差異顯著（p< 0.05）（圖8C）；BEecf由1 mmol/L降低到–2.25 mmol/L，差異顯著（p < 0.05）（圖8F），提示重癥模型組小鼠可能處于呼吸性酸中毒的狀態(tài)。以上血?dú)饨Y(jié)果結(jié)合肺臟組織病理變化，說(shuō)明EV71重癥模型組小鼠肺臟通氣功能低下，處于缺氧和呼吸性酸中毒的病理狀態(tài)。
5. EV71小鼠模型超微病理學(xué)變化
對(duì)照組小鼠肌肉組織可見(jiàn)橫紋明顯，每條肌原纖維都可見(jiàn)清晰明帶和暗帶交替排列，肌質(zhì)內(nèi)含有豐富的線粒體、肌原纖維、高爾基復(fù)合體、溶酶體、糖原顆粒等肌漿內(nèi)含物，糖原顆粒散在分布于肌原纖維間和肌漿中（圖9A），肌細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)清晰的線粒體，或在肌纖維間排列，其內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)（圖9B）。感染組小鼠肌肉組織超微病變明顯，表現(xiàn)為肌組織橫紋消失，明暗帶模糊甚至消失，肌組織發(fā)生退行性變，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)水腫，部分肌原纖維發(fā)生溶解，肌質(zhì)中的胞漿內(nèi)容物減少，糖原顆粒甚至消失（圖9C）；線粒體腫脹、空化，基質(zhì)電子密度降低，內(nèi)室腫脹，嵴和膜結(jié)構(gòu)模糊，嵴突變短減少，崩解消失，形成灶性空化；骨骼肌細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，異染色質(zhì)明顯增多，發(fā)生變性、壞死。并且在肌纖維間可見(jiàn)巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。
對(duì)照組腦組織中神經(jīng)元胞漿中的細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，平行或不規(guī)則排列，其間游離存在核糖體（圖10A）；線粒體豐富，散布于整個(gè)胞體中，線粒體內(nèi)外膜和嵴突結(jié)構(gòu)清晰（圖10B）；腦組織中有髓神經(jīng)纖維髓鞘電子密度均勻（圖10C）。感染組腦組織超微病變輕微，神經(jīng)元細(xì)胞器豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)，線粒體豐富；神經(jīng)元胞漿中可見(jiàn)少量空泡，部分線粒體內(nèi)室腫脹(圖10E)；有髓神經(jīng)纖維髓鞘發(fā)生層面分離，導(dǎo)致小泡性分離，呈現(xiàn)泡狀改變（圖10F）。
對(duì)照組脊髓前角神經(jīng)元常染色質(zhì)明顯，異染色質(zhì)少，細(xì)胞器豐富（圖11A）；脊髓前角神經(jīng)元胞質(zhì)中線粒體豐富，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)達(dá)（圖11B）。感染組脊髓前角神經(jīng)元中粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，出現(xiàn)尼氏小體溶解，核周見(jiàn)微空泡形成；胞核皺縮，異染色質(zhì)增多，細(xì)胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體呈現(xiàn)不同程度的擴(kuò)張，細(xì)胞質(zhì)呈篩狀外觀，并伴隨不同程度的多聚核糖體丟失，導(dǎo)致粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；線粒體腫脹，線粒體嵴突腫脹，嵴數(shù)量減少（圖11C）。小膠質(zhì)細(xì)胞包圍吞噬神經(jīng)元細(xì)胞，呈現(xiàn)嗜神經(jīng)現(xiàn)象（圖11D）。
對(duì)照組肺組織中I型上皮細(xì)胞扁平，其細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)呈淺亮的常染色質(zhì)和呈深色顆粒狀的異染色質(zhì)，胞質(zhì)少而薄，胞漿內(nèi)可見(jiàn)少量細(xì)胞器，與周?chē)?xì)胞連接緊密（圖12A）；肺組織中的II型上皮細(xì)胞核大而圓，常染色質(zhì)細(xì)密，異染色質(zhì)少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、溶酶體等細(xì)胞器豐富（圖12B）；II型上皮細(xì)胞胞漿中可見(jiàn)清晰的特征性包含物——嗜鋨性板層小體（圖12C）。感染組肺組織中I型上皮細(xì)胞核中染色質(zhì)邊集，呈不規(guī)則堆積，并且與周?chē)?xì)胞之間連接松弛（圖12D）；肺組織中II型上皮細(xì)胞核形狀不規(guī)則，染色質(zhì)邊集，核周細(xì)胞質(zhì)電子密度降低，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器減少，胞質(zhì)出現(xiàn)細(xì)小空泡變，嗜鋨性板層小體或出現(xiàn)排空現(xiàn)象，溶酶體增多（圖12F）；肺泡壁中的細(xì)胞成分增多，其中肺泡II型上皮細(xì)胞增生，發(fā)生了間質(zhì)性肺炎。
生物安全性
H1PV為低于人間傳染病名錄三級(jí)安全風(fēng)險(xiǎn)的病原，人類感染風(fēng)險(xiǎn)低。
H1PV是大鼠必須排除的病原體，對(duì)動(dòng)物有致病性。會(huì)干擾其他實(shí)驗(yàn)研究。
鑒于此，此感染實(shí)驗(yàn)必須在BSL-2級(jí)以上的生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)實(shí)驗(yàn)，在ABSL-2實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。
評(píng)價(jià)驗(yàn)證
重癥EV71小鼠模型臨床癥狀可隨著感染時(shí)間增加，表現(xiàn)為豎毛、后肢癱瘓，甚至死亡。
制備方法
2.1 病毒培養(yǎng)
2.1.1 細(xì)胞株
橫紋肌瘤細(xì)胞（RD）。
2.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
SPF級(jí)9日齡BALB/c乳鼠，每窩5 ~ 7只，母鼠自然哺乳。
2.1.3 病毒
EV71臨床分離株基本信息見(jiàn)表1。
表1. EV71臨床分離株基本信息
2.1.4 病毒培養(yǎng)與病毒TCID50的測(cè)定
RD細(xì)胞貼壁覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)瓶生長(zhǎng)成單層后，分別接種EV71病毒株，24 hpi觀察細(xì)胞形態(tài)，待90%的細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于–80℃冰箱中，并反復(fù)凍融3次后，經(jīng)離心后分裝病毒液并低溫保存。采用常規(guī)方法測(cè)定TCID50。在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
2.2重癥EV71小鼠模型建立
根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定攻毒量，建立重癥EV71小鼠模型，9日齡BALB/c乳鼠輕度麻醉后，經(jīng)腹腔注射104.5 TCID50臨床分離株NX10-147(GenBank登錄號(hào)KJ004556)，攻毒劑量為250 μl/只；空白對(duì)照組乳鼠(n=12)腹腔注射等量RD細(xì)胞上清，其中3只取其血清作為對(duì)照組血清。分別在3、6、12 hpi 和1、2、3、5、7、9 dpi采集每組各3只乳鼠血清以備檢測(cè)血清中的細(xì)胞因子。在3 dpi和5 dpi每組各剖殺3只乳鼠，立即取其腦干、脊髓、肺臟、后肢骨骼肌和空腸固定在4 %多聚甲醛中，以備組織病理學(xué)檢測(cè)；同時(shí)，每組另剖殺3只乳鼠取以上組織凍存，以備病毒RNA提取和組織內(nèi)病毒載量測(cè)定。
研究背景
手足口病（hand, foot, and mouth disease, HFMD）是由腸道病毒引起的，以發(fā)熱和手、足、口腔、臀部等部位出現(xiàn)皮疹、皰疹或皰疹性咽峽炎為主要特征的一種常見(jiàn)于小兒的急性傳染病。手足口病多發(fā)生于入學(xué)前兒童，尤其是3歲以內(nèi)的嬰幼兒，少數(shù)患者會(huì)發(fā)展為重癥，并發(fā)無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、神經(jīng)源性肺水腫、急性弛緩性麻痹和心肌炎等，死亡率和致殘率較高。腸道病毒71型（enterovirus71, EV71）是導(dǎo)致手足口病暴發(fā)的主要病原體，是一種高度嗜神經(jīng)病毒，易導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)感染，發(fā)展成重癥，對(duì)重癥死亡患者尸檢表明腦干是其最易感染的部位，因此，重癥手足口病患者表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，以及肺出血、循環(huán)障礙、心臟損害等。
EV71感染主要引起患者發(fā)生手足口病，臨床表現(xiàn)與柯薩奇病毒等其他腸道病毒感染引起的手足口病難以區(qū)別，但EV71感染還能引起無(wú)菌性腦膜炎、腦干腦炎、脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹、神經(jīng)源性肺水腫和心功能衰竭等嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)疾病和并發(fā)癥。
EV71主要通過(guò)糞口途徑傳播，最初EV71病毒定植于鼻咽部或胃腸局部黏膜，侵入淋巴組織并在其中繁殖，并引起第一次病毒血癥，若機(jī)體免疫力差，則EV71可擴(kuò)散入侵全身網(wǎng)狀內(nèi)皮組織、深層淋巴結(jié)、肝、脾、骨髓等組織器官，大量繁殖后再次入血，引起第二次病毒血癥，EV71最終可侵入靶器官細(xì)胞，如腦、腦膜、脊髓、心肌、橫紋肌以及皮膚黏膜等組織，引起重癥病變，導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p害。對(duì)手足口病重癥死亡病例進(jìn)行尸體剖檢，發(fā)現(xiàn)腦組織尤其是腦干中的病變最為嚴(yán)重，表現(xiàn)為神經(jīng)元壞死、腦軟化、嗜神經(jīng)現(xiàn)象、膠質(zhì)結(jié)節(jié)和血管袖套等病毒性腦炎的病理改變，這與腸道病毒的神經(jīng)嗜性相符。一般認(rèn)為間腦、中腦、腦橋、延髓是主要的病理靶區(qū)。EV71感染患者血清和腦脊液中有高水平的IL-1β、IL-6、IL-10、IL-13、IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子表達(dá)。重癥EV71感染還可引起嚴(yán)重的心血管并發(fā)癥，導(dǎo)致嚴(yán)重心肺衰竭而導(dǎo)致死亡，這可能也歸咎于神經(jīng)系統(tǒng)感染及全身炎癥反應(yīng)。
一些特定的臨床指征也可以成為EV71重癥感染患者早期預(yù)警指標(biāo)，其中，主要是屬于神經(jīng)系統(tǒng)癥狀指征，如肢體癱瘓、嗜睡、精神差、驚跳等，也包括呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)癥狀。對(duì)EV71手足口病進(jìn)行臨床特征回顧性分析，發(fā)現(xiàn)重癥手足口病多發(fā)生于3歲以下兒童，有發(fā)熱和皮疹，外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)升高、中性粒細(xì)胞比例升高，血糖升高，神經(jīng)系統(tǒng)異常表現(xiàn)以精神差、驚跳、肢體抖動(dòng)最為常見(jiàn)，危重病例有循環(huán)和呼吸系統(tǒng)異常表現(xiàn)。重型病轉(zhuǎn)化為危重型病有11個(gè)預(yù)警征兆，即布氏癥、肢體癱瘓、肺部痰鳴音、腱反射減弱或消失、瞳孔對(duì)光反射消失、四肢發(fā)涼、嗜睡、精神差、呼吸節(jié)律改變、心率加快、手足抖動(dòng)。高血糖、白細(xì)胞增多和肢體癱瘓是神經(jīng)源性肺水腫的危險(xiǎn)因素，其中高血糖，尤其是患者的血糖值高于8.3mmol/L，是最能夠預(yù)測(cè)病情發(fā)展的臨床指標(biāo)，并且，所有出現(xiàn)肺水腫的患者均有高血糖的征兆。
模型信息
中文名稱:腸道病毒71型BALB/c小鼠模型
英文名稱:EV71 BALB/c mouse model
類型:腸道病毒71型動(dòng)物模型
分級(jí):NA
用途:用于手足口病研究。
研制單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
保存單位:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所
