H5N1禽流感動物模型現(xiàn)狀

到目前為止，已經(jīng)報(bào)道有2種非人靈長類動物（恒河猴、食蟹猴）和4種嚙齒類動物（大鼠、小鼠、田鼠、沙鼠），雪貂、家貓以及雞、鴨等禽類可以作為H5N1禽流感病毒動物模型用于實(shí)驗(yàn)研究。低致病性H5N1禽流感病毒可以通過適應(yīng)建立鼠肺適應(yīng)株感染小鼠建立小鼠模型。非人靈長類動物通過鼻腔吸入較難感染，通常需要借助輔助器材進(jìn)行定位感染，動物感染后體征變化不顯著，肺組織出現(xiàn)局灶性病變。

前期研究顯示雪貂的受體分布情況與人極為接近，呼吸氣道長，上下呼吸道分腔明顯是流感病毒研究最為理想的動物模型，缺點(diǎn)是雪貂受物種特異性限制缺乏相應(yīng)的檢測試劑。小鼠對多種流感病毒敏感，一直被選擇作為流感病毒研究的動物模型，不僅有完備的檢測試劑，還有相應(yīng)的基因敲除、轉(zhuǎn)基因小鼠可用于機(jī)制方面的研究。早期研究曾在多種非人靈長類動物中（非洲綠猴、Pata猴、豬尾猴、食蟹猴）檢測到血清抗體陽性，并推測猴群感染病毒參與了流感大流行。研究發(fā)現(xiàn)非人靈長類動物感染禽流感病毒后的臨床改變、病理變化、抗原分布都與人類存在一定差異，研究結(jié)果顯示其對流感病毒敏感性較雪貂、小鼠低。至今沒有直接證據(jù)表明非人靈長類動物的受體分布情況與人接近。恒河猴中研究局部肺組織損傷機(jī)制不僅與巨噬細(xì)胞有關(guān)，在研究抗補(bǔ)體機(jī)制中還應(yīng)考慮PAMP的參與，NF-κB 等炎癥信號途徑的作用，這些研究在非人靈長類中受到一定限制，目前小鼠可以提供多方面抗補(bǔ)體機(jī)制研究。

1 受體比較

1) 人呼吸道上皮受體分布情況：α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體主要分布在鼻粘膜上皮細(xì)胞, α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體分布在鼻旁竇、咽、氣管、細(xì)支氣管上皮上。在終端呼吸性細(xì)支氣管上皮細(xì)胞也表達(dá)α-2，6連接唾液酸糖蛋白受體。α-2，3連接唾液酸糖蛋白受體出現(xiàn)在呼吸細(xì)支氣管與肺泡交界的無纖毛立方細(xì)支氣管細(xì)胞上，部分肺泡壁細(xì)胞表達(dá)這種受體，這種細(xì)胞為肺泡Ⅱ型細(xì)胞。病人感染H5N1禽流感病毒后，病毒主要分布在肺泡Ⅱ型細(xì)胞內(nèi)。

2) 雪貂除了氣管中極少數(shù)杯狀細(xì)胞既表達(dá)α-2，3SA受體又α-2，6SA受體，其上下呼吸道受體分布與人極為相似，小鼠多表達(dá)α-2，3SA受體，α-2，6SA受體較少，曾局限的認(rèn)為小鼠較適合用于α-2，3SA受體結(jié)合的病毒研究，后有研究發(fā)現(xiàn)受體特異性并不影響某些病毒對小鼠的致病力和復(fù)制能力。

3)有研究顯示通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)非洲綠猴上皮細(xì)胞與人類流感病毒和禽類流感病毒都有較好的結(jié)合能力，與人類上皮細(xì)胞的結(jié)合能力接近。缺乏實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示其受體與人類受體分布相似度。

2 感染途徑比較

1) 小鼠、雪貂通過輕微麻醉后，以吸入式方式感染，感染方式與人極為接近。

2) 恒河猴、綠猴、食蟹猴等需要以環(huán)甲膜穿刺、支氣管鏡定位感染等方式進(jìn)行感染，感染途徑與自然感染途徑差別較大，感染效果通常會出現(xiàn)肺組織局域性灶狀感染，與吸入性感染方式產(chǎn)生的病變程度、范圍存在一定差別。

3 感染后癥狀

1) 部分禽流感病毒在猴上皮細(xì)胞中復(fù)制受限或者發(fā)生不同程度的衰減。例如禽來源的H2N2病毒不能感染猴，H5N1高致病性禽流感病毒需要以高出雪貂感染劑量103倍的劑量感染猴，仍不致死，僅產(chǎn)生一過性體溫升高。

2) 幾乎所有禽流感病毒都能夠在雪貂中成功復(fù)制，并產(chǎn)生臨床可觀察的改變，例如體溫升高、體重下降、噴嚏、流涕、精神萎靡甚至死亡。

3)H5N1禽流感病毒感染小鼠后出現(xiàn)嚴(yán)重的肺炎，除呼吸道以外還在腦、脾、肝等組織中發(fā)現(xiàn)病毒抗原，并在腦組織中出病理改變，猴感染后在呼吸道以外的組織中未發(fā)現(xiàn)病毒抗原。

CRP基因敲除小鼠和人CRP轉(zhuǎn)基因小鼠在賽業(yè)（蘇州）生物科技有限公司模式動物研究中心完成，該中心具有符合國際標(biāo)準(zhǔn)的動物模型制備相關(guān)完備監(jiān)督管理制度。動物的繁殖及感染模型評估在中國疾控中心動物中心完成，所有操作在SFP級別下遵守二級生物安全管理規(guī)定進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)動物尸體實(shí)行無害化處理，對生態(tài)環(huán)境無影響。

1.恒河猴感染后臨床表現(xiàn)

感染后第2天恒河猴攝食量開始減少、自主活動減少。感染后第1天體溫達(dá)到峰值，第3天時(shí)回落至正常范圍，除以上癥狀外恒河猴未出現(xiàn)其他明顯臨床表現(xiàn)(圖1) 。

2. 病毒分離和載量的檢測

鼻灌洗液和咽拭子的病毒分離和核酸載量檢測結(jié)果: H5N1感染1d后，每天采集鼻灌洗液和咽拭子至第7天，病毒培養(yǎng)鼻灌洗液除第4、5天為陰性結(jié)果外，其余均為陽性。咽拭子除第7天為陰性外第1～6天均為陽性(表1) 。病毒陽性的細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為: 腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞核固縮或破裂，細(xì)胞部分或全部脫落，血凝實(shí)驗(yàn)中紅細(xì)胞也發(fā)生凝集現(xiàn)象。病毒載量結(jié)果顯示鼻灌洗液及咽拭子于感染后第1天載毒最高，此后逐漸下降(表2)。

血液的病毒分離和核酸載量檢測結(jié)果: 恒河猴感染H5N1 病毒前2d 及感染后第3、5和7天靜脈取血，002號恒河猴在感染后第3天血液中H5N1病毒分離成陽性，血凝實(shí)驗(yàn)復(fù)檢結(jié)果一致。核酸載量也達(dá)104 copies/mL( 表3)。

組織器官的病毒分離和核酸載量檢測結(jié)果:H5N1 感染后第3天和第7天各安樂一只恒河猴，剖取支氣管淋巴結(jié)、腸淋巴結(jié)、鼻甲、心、肝、脾、肺、腎、腸、氣管、腦組織進(jìn)行病毒分離和核酸載量檢測。除肺組織外，在恒河猴的心，氣管，腦，肝，腎，腸多處組織器官中也能分離到H5N1 病毒(表4) ，血凝試驗(yàn)復(fù)檢結(jié)果一致。病毒載量檢測結(jié)果顯示，所取組織中均存在高達(dá)105～107 copies/g的H5N1核酸拷貝(表5) 。

恒河猴感染H5N1 病毒前2 d及感染后第3、5、7天采靜脈血，進(jìn)行血常規(guī)檢測，結(jié)果如表6所示。感染后與感染前相比恒河猴白細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞數(shù)下降，其他指標(biāo)均無明顯變化。

非人靈長類實(shí)驗(yàn)動物以其具有與人類最為相似的生理結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)應(yīng)答，已被用作禽流感感染動物模型，但有文獻(xiàn)報(bào)道該模型對H5N1病毒的敏感性較低，不能完全模擬人類重癥患者的發(fā)病特征?？紤]到感染途徑最有可能影響感染效果，本研究探索應(yīng)用氣管插管的新式感染H5N1病毒方法感染恒河猴，旨在改良以往模型的低敏感性，并密集動態(tài)檢測病毒在體內(nèi)的分布，為深入研究禽流感發(fā)病機(jī)制，篩選有效疫苗和治療藥物提供一個(gè)良好的技術(shù)平臺。

恒河猴年齡5歲，雄性，2只。H5N1、H1N1 和季節(jié)性流感病毒抗體經(jīng)檢測均呈陰性。實(shí)驗(yàn)前恒河猴麻醉后將體溫芯片植入其頸部后方、肩胛骨上方的背中線位置，每天用數(shù)據(jù)收集器掃描芯片來測量猴的體溫。實(shí)驗(yàn)的觀察期為5天。皮下植入體溫芯片用于監(jiān)測體溫、體重變化。每日觀察食蟹猴臨床癥變化，在感染后第5天處死動物，取組織樣本用于監(jiān)測病毒復(fù)制動力曲線和動物感染后組織炎癥反應(yīng)檢查。

禽流感依據(jù)其對禽類的致病能力大小可以分為三個(gè)程度：高致病性、低致病性和無致病性。其中高致病性禽流感包括H5和H7 兩個(gè)亞型。但并非所有的H5 和H7 都是強(qiáng)毒株。人高致病性禽流感是由高致病性禽流感病毒某些亞型的毒株引起的人急性呼吸道傳染病。由H5N1亞型禽流感引起的癥狀較重，病死率高。1997年，香港一名3歲的男童因感染禽流感而死亡，在隨后的幾個(gè)月中，共有18個(gè)人感染禽流感病毒，其中6人死亡。之后相繼有H9N2、H7N7亞型禽流感感染人類和 H5N1 亞型再次感染人類的報(bào)道,禽流感與人禽流感的關(guān)系開始倍受關(guān)注。2003年12 月中旬開始至今,朝鮮、越南、泰國、韓國、日本和中國等10 余個(gè)亞洲國家先后暴發(fā)H5N1高致病性禽流感疫情,并且再越南、泰國、柬埔寨以及印度尼西亞出現(xiàn)了人感染高致病性禽流感病毒病例。據(jù)最新資料報(bào)道，世界衛(wèi)生組織已證實(shí)泰國、越南和柬埔寨以及印度尼西亞自2004年1月起截至到2005年8月20日共有112人感染，其中導(dǎo)致57人死亡。而H7N7感染引起的癥狀相對較輕僅以眼角結(jié)膜炎和輕微的呼吸道癥狀為主。追溯歷史，有報(bào)道的第一次禽流感感染人的事件發(fā)生在上個(gè)世紀(jì)的70-80年代的幾例以自限性結(jié)膜炎為臨床特征的H7N7感染病患。最近的一次發(fā)生在2003年荷蘭一家農(nóng)場有近80名工人及家屬被確診為H7N7感染,他們以眼部感染和呼吸道癥狀為主,其中一名獸醫(yī)死亡,他的家人未接觸病禽但也被證實(shí)H7N7感染。這起事件具有有限的人傳人的證據(jù)。

禽流感病毒感染患者臨床表現(xiàn)及致病機(jī)制

H5N1禽流感病毒感染的潛伏期一般為2～4天，平均3天。發(fā)病前1天就開始排毒，排毒時(shí)間兒童比成人長，免疫抑制者排毒可長達(dá)一個(gè)多月。臨床表現(xiàn)為急性起病，早期表現(xiàn)類似一般流感。主要為發(fā)熱，體溫大多持續(xù)在38℃以上，熱程1～7天，一般為3～4天，可伴有流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、頭痛和渾身不適。少數(shù)患者可有惡心、腹瀉、稀水樣便等癥狀。重癥患者病情發(fā)展迅速，可出現(xiàn)肺炎、急性呼吸窘迫綜合征、肺出血、胸腔積液、全血細(xì)胞減少，腎功能衰竭，敗血癥、休克及Reye綜合征等多種并發(fā)癥。